l'éléctrophorése et application ses protéines

Sommaire :

Liste des figures

Introduction

Chapitre I : Généralité

1-Historique……………………………………………………………………

2-Définition d’électrophorèse…………………………………………………

3- But…………………………………………………………………………

4-principe………………………………………………………………………

1-4 les montages d’électrophorèse :

1 1-4 montage horizontal………………………………………………………

1 2-4 montage vertical…………………………………………………………

5- Protéines…………………………………………………………………….

    5-1-Définition…………………………………………………………………

    5-2-Structure……………………………………………………………………

Chapitre II : Matériels et méthodes

1-Matériel : 

       1-1Appareillage……………………………………………………………

1-2 petits matériel…………………………………………………………

1-3  Les produits chimiques et réactifs………………………………………

1-4  Principales matrices d'électrophorèse …………………………………

         1-4-1-Gel de polyacrélamide ou PAGE………………………………………
         1-4-2-Gel d’agarose…………………………………………………………

2-méthode :

2-1Préparation de l'échantillon………………………………………………………

    2-1-1-Extraction…………………………………………………………………

2-2 électrophorèses en gel de polyacrélamide…………………………………………………………………

2-3 SDS- PAGE……………………………………………………………………

2-4 agarose…………………………………………………………………………

2-5 PH discontinu…………………………………………………………………

2-6 focalisations isoélectriques…………………………………………………………………….

2-7 Électrophorèse en gel à deux dimensions

2-8 comptage radioactif………………………………………………………

2-9 Immunotransfert « western blot »………………………………………

Chapitre 03: les applications

1-applications………………………………………………………………………

2-exemple d’électrophorèse…………………………………………………………

3- avantages…………………………………………………………………………

4-inconvénients………………………………………………………………………

Conclusion

Références bibliographique

Résumé

 

Introduction :

Comme il est possible de séparer les types cellulaires vivants qui constituent un tissu, il est possible de séparer les organites fonctionnels  et les macromolécules d’une cellule. Dans cet exposée, nous considérerons les méthodes qui permettent de séparer et analyser  biochimiquement les protéines, alors comment réaliser la séparation de la protéine ?

 

1- Historique :

Cette technique a été imaginée en 1892 par S.E. Linder et H. Picton qui se sont inspirés des travaux d’Hermann Von Helmholtz sur l’électro-osmose.  En effet, ce dernier constata qu’il était possible de déplacer des particules chargées sous l’effet d’un champ électrique.

1937 : Arne W. K. Tiselius met au point la première électrophorèse dite libre. Grâce à cette technique, il parvient à séparer les protéines du sérum sanguin. Les protéines de charge très négative comme l’albumine sont attirées par la borne positive tandis que les protéines de charge très positive comme les globulines sont attirées par la borne négative.

1952 : Pierre Grabar élabore l’analyse imuno-électro phorétique qui permet d’analyser de manière précise des mélanges d’antigènes.

1955 : O. Smithies met au point une technique d’électrophorèse sur gel d’amidon. (1)

2-Définition :

L’électrophorèse est un terme d’origine grecque signifiant transport (TRIVIN ET LEBRIN, 2003). Découverte par Tiselius en 1937, elle s’est affirmée comme l’une des méthodes d’analyse les plus avantageuses de la chimie des macromolécules.

L’électrophorèse c'est-à-dire le déplacement de l’ion dans un champ éléctrique.est couramment utilisée pour séparer des molécules biologiques on désigne l’électrophorèse vertical est consiste pour séparer les protéines en gel. (VOET D et VOET J, 2005).

3-But :

-séparer les protéines.

-identifier les fractions protéiques.

-déterminer les fractions protéiques. (2)

4-Principes:

    Dans les techniques électrophorétique, la séparation des protéines est obtenue par application d’un champ électrique de bas voltage « 110 v »en courant contenu, au mélange de protéines à séparer. La charge des protéines varie selon le PH des tampons utilisés: une protéine chargée positivement se dirigera vers la cathode, une protéine chargée négativement se dirigera vers l’anode, une protéine non chargée restera au niveau du dépôt; dans ce dernier cas; le PH du tampon est égal au PH isoélectrique de la protéine. (KAMOUN et all. 2003).

Après fixation et coloration par un colorant spécifique des protéines, chaque protéine apparaît sous forme d’une bande dont la position permet l'identification. (3)

1-4 Les montages d’électrophores: deux  types de montage peuvent être mis en place :
1-1-4 Montage horizontal:
    Utilisé pour les supports en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme de longue et étroite bande.
Les extrémités du support plongent dans un tampon d'électrode, créant une mince couche d'eau à sa surface.
1-2-4  Montage vertical:
   Utilisé pour les supports en gel polyacrylamide ou, plus rarement d’agarose. Le gel est souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Durant la gélification on aura pris soin de faire des puits où on déposera les échantillons. Chaque extrémité du gel est mise en contact avec un tampon contenant des électrolytes qui permettra la propagation d'un courant dans le gel. (4)

5-protéines :

5-1 Définition des protéines :

Les protéines sont des macromolécules de masse molaire supérieure à 10000 molécules, elles sont formées d’acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques.

Une protéine comporte un moins 100 acide aminéé.par convention, on écrit le groupement

NH2-libre à gauche, c’est l’acide aminé numéro 1(MARLENE.F et all, 2008).

 

5-2 Structure des protéines :

La structure primaire :

Est la séquence en acides aminés de sa (ses) chaine(s) polypeptidique(s) ; pour un acide nucléique, c’est la séquence de ses bases. (VOET.D et all, 2005), La structure primaire conditionner le repliement de la protéine (par exemple, il y a renaturation spontanée de la ribonucléase après rupture des ponts disulfures par dénaturation par l'urée ou le mercaptoéthanol. (5)

La structure secondaire :

      Sous l’influence de diverses forces attractives et répulsives, les chaînes polypeptidiques

      Ne gardent pas une structure linéaire. On appelle structure secondaire les divers repliements  structurés   dans   l’espace   de   la   chaîne   polypeptidique.   Des   liaisons   hydrogène,  Interviennent   dans   ces    repliements,  impliquant   les  groupements  C=O      et   N–H de deux liaisons peptidiques. Les deux principales structures secondaires sont l’hé-   lice α et le feuillet plissé β. Ces deux structures sont généralement reliées entre elles par

      Des boucles de longueur variable et de structure irrégulière. De telles boucles ne forment

      Pas de liaisons hydrogènes entre elles ; de plus, elles sont situées plutôt à la surface de

      la protéine. Les interactions hydrophobes dues aux chaînes latérales des acides aminés

      N’interviennent pas directement dans la stabilité de cette structure secondaire.

       Certaines séquences d’acides aminés favorisent soit la formation d’hélices α, soit de

      Feuillets β. Par exemple, les acides aminés Ala, Glu et Met favorisent la formation

      D’une hélice α, alors que les acides aminés Pro, Gly, Tyr et Ser ne sont pas favorables (BARATTI.C et all, 2008)

Structure tertiaire:

Stabilisation de la structure tertiaire d'une protéine peut impliquer des interactions entre les acides aminés situés éloignés le long de la séquence primaire. Il peut s'agir:

Interactions faibles : telles que des liaisons hydrogène et interactions Van der Waals. (6)

Interactions hydrophobes : liaisons de coordination (comme les doigts de 

Zinc), ponts disulfures . (5)

Des liaisons ioniques : impliquant chargé négativement et positivement chargé d'aminoacides à chaîne latérale des groupes.

Liaisons disulfure : des liaisons covalentes qui peuvent formé des groupes thiol que de deux résidus  RSER et cystéine sont oxydés en un disulfure: 2 R-SH . (6)

La structure tertiaire correspond aux repliements de la chaîne protéique sur elle même. Ces repliements sont  Conditionnés par la séquence primaire de la protéine, Seules les protéines globulaires ont une structure tertiaire. 

La structure tertiaire des protéines définit des unités de plicatures qui correspondent à des "modules" ou  Domaines fonctionnels que l'on trouve sur des protéines différentes,

Exemples de domaines fonctionnels :

         Les doigts de zinc des facteurs de transcription :

Ils possèdent deux brins bêta et une hélice alpha (soit une trentaine d'acides aminés) 

Stabilisés par le zinc (qui permet la coordination entre deux cystéines et deux histidines). 

C'est l'hélice alpha qui sera en contact avec l'ADN grâce à des liaisons hydrogènes entre un acide aminé et trois  ou quatre paires de base (on a donc en gros, un doigt de zinc pour un triplet de nucléotides).

       La superfamille des immunoglobulines (ou anticorps) :

Ce sont des protéines présentant différents domaines (douze en tout), d’une centaine d'acides aminés chacun stabilisés par des ponts disulfures, et formant des feuillets plissés bêta. Ces protéines sont impliquées dans  la défense immunitaire : Il y a par exemple les RCT, les  IgM et les HLA.

Les anticorps sont les effecteurs de la réponse humorale (dans le sang). (5)

 

 Structure quaternaire :

La structure quaternaire correspond a l’association spécifique de plusieurs chaines peptidiques en une unité d’ordre supérieur seule capable d’assurer complètement les fonctions biologique. (AUDIGIE.C et all, 2007), La structure quaternaire est la formation d'agrégats protéiques non covalents (liaisons faibles comme des interactions hydrophobes, des liaisons ioniques, des liaisons hydrogènes), Les sous-unités (SU), appelées protomères, ainsi groupées, forment une protéine dite oligomérique (BARATTI.C et all, 2008).

 Hémoglobines, enzymes comme la thréonine désaminase ; le glutamate déshydrogénase, etc.) Est constituée par l’association de plusieurs chaines peptidiques ou protomères (deux chaines α et deux chaines β pour l’hémoglobine humaine normale).

Les su  peuvent être associées ou non par des liaisons covalentes.

Les SU ne sont pas toujours identiques, mais elles le sont souvent deux à deux. Ces SU peuvent fonctionner soit indépendamment les une des autres, soit de façon Coopérative de telle sorte que l’activité d’une SU dépend de l’état des autres SU.

L’assemblage réalisé par des laissons secondaires se fait de façon spécifique et selon une certaine symétrie. Il conditionne l’activité de la protéine. La glycéraldéhyde-3P déshydrogénase (humaine) a 4 SU identiques de 35 kDa (cas   D’un homo-oligomère), tandis que l’hémoglobine (humaine) a 4 SU identiques, Deux (structure α2β2), avec une masse moléculaire de 16 kDa environ chacune (cas D’un hétéro-oligomère), Dans  la   technique  SDS-PAGE,  la  migration des polypeptides  ne Dépend que de leur masse. Les conditions dénaturantes imposées par le dodécyle sulfate de sodium (SDS) et par le mercaptoéthanol conduisent à la séparation des protéines oligomères en leur SU dénaturées. Dans les conditions dites natives, c’est-à-dire en absence de SDS, les protéines peuvent conserver leur structure quaternaire. (BARATTI.C et MARECHAL., 2008)

 

1-Matériel :
1-1 Appareillage:
La réalisation d’électrophorèse nécessite :
-  une « cuve à électrophorèse » essentiellement constituée de deux bacs contenant le tampon et une électrode. Anode et cathode sont reliées à un générateur de courant continu. (7)
-  une cuve de révélation des produits séparés.
- Plaque de verre pour couler le gel.     
 -vortex
-incubateur
1-2 petits matériels:
Les manipulations ont néssecité aussi l'usage d'accessoires spécifiques, notamment :
-Des peignes
-Des espaceurs
-micropipette
 -eppendorfs
1-3 Les produits chimiques et réactifs :
-Solvant usuels : acide acétique, méthanol, glycérol, isopropanol, 2-marcaptoéthanol, Dithiothréitol…etc.
Sels et tampons : glycine,trishydroxyméthyl aminaminométhane (Tris).
Réactifs spécifiques : acrylamide, N, N'-méthylène -bis acrylamide, N, N, N', N'-tétraméthyléthylène-diamine (TEMED), persulfate d’ammonium, dodécyl sulfate de sodium (SDS), Blue de Coomassie R250, acide trichloracétique (TCA) …etc
1-4 Principales matrices d'électrophorèse : 
1-4-1Gel de polyacrélamide ou PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophorèses):
    Qui est le produit d'une polymérisation du monomère acrylamide (CH2 = CH - CO -NH2) et du Co-monomère N, N'-méthylène -bis acrylamide (CH2 = CH - CO – NH-CH2 = NH -CO – CH=CH2) et ce, en présence du persulfate d'ammonium (NH4)2S2O8 et du N, N, N', N'-tétraméthyléthylène-diamine (TEMED) comme catalyseurs de la réaction.
 
1-4-2 Gel d’agarose:
    Présent des pores plus gros que les gels de polyacrélamide, ils sont adaptés a la séparation des grosses protéines ou des acides nucléiques .les gels d’agarose sont aujourd’hui couramment utilisés pour l’électrophorèse des protéines sériques, des lipoprotéines, des hémoglobines ou pour la séparation des iso-enzymes.  (VAUBOURDOLLE.M., 2007).
Agarose est normalement acheté sous forme de poudre sèche. Il se dissout lorsque le poudre en suspension est chauffée à une valeur proche d'ébullition et il reste jusqu'à ce que le liquide la température chute à environ 40 º C, quand il gels ou «ensembles».
La taille des pores et les caractéristiques de tamisage d'un gel sont déterminées par
Ajuster la concentration de l'agarose dans le gel. Le plus élevé de la concentration, plus la taille de pores. Concentrations de travail sont normalement dans la plage de 0.4 à 4% p / v
  Gels d'agaroses ont relativement fragiles et doivent être manipulés avec soin. Les gels sont des hydro colloïdes, maintenus ensemble par des liaisons hydrogène et hydrophobes, et ont tendance à être un peu fragile.
Un gel d'agarose doit toujours traitées avec une forme de support pour l'ensemble de gel, par exemple un tiroir Spatule large, parce que le gel se cassesielle se plie trop loin. (SIBOUKEUR.O).
 2-méthodes :
2-1 Préparation de l’échantillon :

2- 1-1 Extraction des protéines sériques:

Elle a été réalisée à partir du sérum des patients malades (lupus) obtenu après centrifugation et recueilli dans des eppendorfs de 1.5 ml.

En premier lieu, on rajoute aux sérums 100ul de la solution d'extraction composée de la solution stock à base de SDS à 10%  et d'un réducteur de Dithiothréitol  (DTT) à 1% pour extraire et réduire nos protéines.

En second lieu, le contenu de chaque tube est vortexé puis incubé à 60°C pendant 30min. (10)

a) Réalisation de l'électrophorèse:

Il s'agit d'une électrophorèse monodimensionnelle en présence du SodiumDodécyl-Sulfate sur gel polyacrylamide (SDS-PAGE) Préparation des gels:

Dans la méthode de séparation par SDS-PAGE nous devons préparer deux types de gels : Un gel de séparation qui permet de fractionner les différentes protéines et les sous-unités protéiques selon leurs poids moléculaires et un gel de concentration permettant de retenir les impuretés et de tasser les protéines.

Avant de préparer les gels on doit procéder au montage des plaques, après les avoir nettoyées à l'éthanol. On les place l'une contre l'autre en les séparant avec deux éspaceurs dont la largeur est choisie.

- Le gel de séparation (running gel):

Le gel est à T=12.8% et C=0.97%.Ces dimensions sont de 180x160x1.5 mm. Il est constitué d'acrylamide à 35% (p/v), de N-N'-Méthylen-Bisacrylamide à 2% (p/v), de Tris HCL à pH=8.8, de SDS à 10% (p/v) et d'eau distillée. La réaction de polyacrylamide est catalysée par l'ammonium persulfate (APS) à 1% (p/v) et le TEMED. Une fois tous les constituants mélangés (les catalyseurs sont ajoutés en dernier lieu), il est coulé entre les plaques (montées auparavant) doucement pour ne pas faire de bulles jusqu'à un niveau délimité sur la plaque pour laisser la place au gel de concentration (à 4 cm de l'encoche). Ensuite, on coule une fine couche de butanol pour égaliser la surface du gel et pour éviter son contact avec l'air (pour faciliter la polymérisation). Au bout de 30 à 45 minutes le gel prend, on se débarrasse du butanol et on rince à l'eau distillée.

-Le gel de concentration (stacking gel):

Le gel est à T=2.8% et C=1.4%. Il a les dimensions de 180x40x1.5 mm.

Il est constitué de la même façon que le gel de séparation avec une seule différence au niveau du Tris HCL qui a un pH de 6.8.Le gel est coulé sur le gel de séparation, les peignes sont posés bien centrés entre les plaques et sans faire de bulles. Le gel prend après 45 à 60 minutes, les peignes sont retirés soigneusement pour ne pas casser les puits. Enfin, on verse du tampon dans les puits est on fait les dépôts.

b) Le tampon d'électrophorèse:

Le tampon de migration est constitué de glycine à 1.41% (p/v), de Tris à 0.3% (p/v) et de SDS à 0.1% (p/v).

c) La migration:

Après le dépôt des différents échantillons ; la cuve d'électrophorèse (bac inférieur) est remplie à un niveau suffisant avec le tampon d'électrophorèse.

    Ensuite, le bac supérieur situé entre les deux plaques (bien serré contre les joints pour éviter les fuites) est rempli lui aussi avec le même tampon jusqu'à ce que les faces supérieures des gels soient immergées. Ensuite, ce dernier est placé dans la cuve d'électrophorèse pour que les faces inférieures des gels plongent dans le tampon. Enfin, la cuve est fermée et est reliée à un générateur qui va assurer le passage du courant électrique. La migration est menée à une intensité constante de 40mA/gel.

d) Fixation et coloration:

Après la sortie du front de migration (coloré en bleu), la migration est arrêtée. Les gels sont démoulés et récupérés dans des bacs en plastique puis recouverts avec une solution de coloration est constituée d'un fixateur des protéines, le TCA (acide trichloracétique) à 60% et d'un colorant, le bleu de Coomassie R250. Les gels doivent être maintenus en agitation pendant 24 heures pour éviter le dépôt du colorant. Après ils sont décolorés dans de l'eau. (10)

2-2 Electrophorèse en gel de polyacrylamide :

Les protéines sont poussées par un courant appliqué à un gel composé d’une petite molécule organique (l’acrylamide) qui forme un filtre moléculaire par des interactions croisées. Le gel peut être formé d’une mince tablette serrée entre deux plaques de verre ou d’un cylindre placé dans un tube de verre. Quand le gel est polymérisé, la tablette(ou le tube) est suspendue entre deux compartiments qui contiennent un tampon, dans lequel sont plongées des électrodes opposées. Dans un gel en plaque, l’échantillon contenant la protéine concentrée est placé dans des fentes le long de la partie supérieure du gel.

L’échantillon de protéine est préparé dans une solution contenant du saccharose ou du glycérol, dont la densité empêche le mélange de l’échantillon avec le tampon dans le compartiment supérieur. On applique ensuite une tension entre les compartiments et le courant passe par la tablette, provoquant le déplacement des protéines vers l’électrode de charge opposée. Pour la séparation, on utilise habituellement des tampons alcalins, qui donnent aux protéines une charge négative et les font migrer vers l’anode chargée positivement à l’autre extrémité du gel.

Le déplacement relatif des protéines dans un gel de polyacrylamide dépend de la taille, de la forme et de la densité de charge (charges par unité de masse) de la molécule.

On peut suivre la progression de l’électrophorèse en observant la migration d’un colorant pisteur chargé qui se déplace juste devant les protéines les plus rapides. Après un certain temps, le courant est coupé et le gel est enlève du récipient. On peut colorer le gel pour mettre en évidence la localisation des protéines. Si les protéines sont marquées par radioactivité, on peut déterminer leur position en appliquant le gel sur un morceau de film sensible aux rayons X et obtenir une autoradiographie. D’autre part, on peut couper le gel en fractions et isoler les protéines individuelles, ou appliquer le gel contre un morceau de papier filtre en nitrocellulose et le soumettre à un autre traitement électrophorétique qui fait sortir les protéines du gel et les adsorbe à la surface de la nitrocellulose.(GERALD,1998).

2-3 SDS-PAGE :

La séparation des protéines  ou de leur sous-unité protéiques et la détermination précise de leur poids moléculaire sont possibles par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (dodécylsulfate de sodium,CH3------ (CH2)10-----CH2OSO3Na). Les sous –unités sont dissociées par le SDS et la dissociation est rendue complète par l’addition d’urée et surtout de 2-mercaptoéthanol,qui permet de rompre les ponts disulfure inter-ou intrachaines. Les chaines polypeptidiques fixent par gramme une quantités constante de SDS(1,4g de SDS par gramme de protéine).les chaines prennent alors la forme de bâtonnets ayant le même diamètre et dans la longueur est proportionnelles au nombre d’acide aminés, donc au poids moléculaire de la chaine.(PIERRE et all,2003).

Chaque molécule protéique fixe un grand nombre de molécules détergentes négativement chargées  qui masquent la charge intrinsèque de la protéine et provoquent sa migration vers l’électrode positive lors qu’une tension est appliquée. Les protéines de même taille ont tendance  à se déplacer à travers le gel avec la même vitesse  parce que

1-leur structure d’origine est complètement dépliée par le SDS, donc leur forme est identique

2-elle fixe la même quantité de SDS et donc ont la même quantité de charge négative les protéines plus grosses, plus chargées, seront soumises a de plus grandes forces électriques et donc a un plus grand entrainement. Le réseau de gel polyacrélamide qui agit comme un tamis moléculaire, les grandes protéines sont beaucoup plus retardées que les petites. Il en résulte qu’un mélange complet de protéines est fractionné en une série de bandes protéiques délimitées placées dans l’ordre de leur masse moléculaire. Les protéines majeures sont facilement détectées par leur coloration dans le gel avec du bleu de coomassie par exemple et même les protéines mineures sont visibles sur des gels traités avec une coloration argent ou or(qui permettent de détecter sur une bande de quantités aussi minimes que 10 ng de protéine) ( ALBERTS.B et all,2004).

 

2-4 Gel d’agarose : 

L’électrophorèse de protéines sur gel d’agarose est la technique la plus aisée et la moins coûteuse à mettre en œuvre dans un établissement d’enseignement avec un matériel limité. Elle nécessite simplement une cuve à électrophorèse et une alimentation continue(11)

Le protocole de gel d’agarose  est semblable à celui de polyacrélamide l’agarose a une meilleure sensibilité et permet une meilleure résolution des fractions protéiques.
La détection des bandes de faible intensité est plus performante  gel initial est transparent, ce qui permet une bonne évaluation par densitomètre La faible concentration en agarose explique la large porosité du gel et la libre migration des molécules sans phénomène de distorsion (grosses protéines et lipides). (12)

Elle est peu utilisée dans le cas des protéines, car dans ce domaine les gels de polyacrélamide donnent toute satisfaction

La lecture peut se faire à l'œil nu (analyse qualitative) ou par densitomètre (enregistrement de l'absorbance en fonction de la distance de migration) ; dans ce cas, l'intégration des pics permet une analyse quantitative des fractions; ou encore le dosage peut être effectué après élution des fractions. (13)

2-5 Electrophorèse à PH discontinu :

Afin d’augmenter la résolution et donc restreindre les protéines dans des bandes plus minces, le gel peut être modifié en utilisant deux gels dans des tampons différents:

- un gel de séparation (running gel), préparé comme le gel précédent

 - un gel de concentration (stacking gel), qui surmonte le gel de séparation et qui est de plus haute porosité

- le tampon dans le réservoir du bas et celui du gel de séparation sont identiques

- le tampon du gel de concentration possède un pH ~ 2 unités de moins.

- le pH du tampon dans le réservoir supérieur doit contenir un acide faible (typiquement de la glycine,pKa = 9.78) et son pH est ajusté prèsde celui du réservoir inférieur.

 

- quand le courant est branché, les ions du tampon du réservoir supérieur migrent dans

Le gel de concentration.

-les ions du réservoir supérieur rencontrent un pH inférieur à leur pKa (pH< 9.8)

- par conséquent l’acide faible (glycine) devient neutre et électrophorétiquement immobile.

-ceci produit une déficience en transporteurs de charges et la production d’une haute

résistance électrique, R, qui à cause un courant constant imposé, I, résulte selon la loi d’Ohms (E=IR) en un champ électrique (E) très élevé.

-ce champ électrique plus fort fait en sorte que les protéines migrent plus rapidement dans le gel de concentration.

- quand les anions atteignent le gel de séparation (où le pH est supérieur au pKa de

La glycine), les ions du tampon retrouvent leur charge.

- les protéines ralentissent vu qu’il n’y a plus de déficience en ions à cet endroit.

- cet effet a comme résultat de comprimer les protéines en bandes très minces

(~ 0.01mm) et ordonnées selon leur mobilité lorsqu’elles entrent dans le gel de séparation

- ce qui minimise la diffusion dispersive des protéines.

- quand les protéines entrent dans le gel de séparation, elles sont retardées selon leurs tailles par l’effet de filtration du gel:

- petites protéines migrent plus rapidement

- grosses protéines migrent plus lentement

- puisque le pH du tampon de séparation est plus élevé, les ions du tampon du

Reprennent leur propre charge quand ils pénètrent le gel de séparation

- la déficience en transporteurs de charges a donc disparu et à partir de ce point

La séparation électro phorétique procède de façon normale.

- l’important est que la réduction dans les bandes macromoléculaires en rentrant dans le gel de séparation augmente de façon très significative la résolution du point de vue de la séparation des macromolécules. (14)

2-6 Focalisation isoélectrique :

La focalisation isoélectrique est un type d’électrophorèse dans lequel le milieu de support est un gel contenant un mélange d’ampholytes, polymères de faible poids moléculaire avec des proportions différentes de groupements amine chargés positivement et de groupement carboxyle chargés négativement. Quand une tension est appliquée au gel, les molécules d’ampholyte se redistribuent, les plus négatives se rapprochant de l’anode et les plus positives de la cathode. Ce déplacement établit un gradient stable de PH entre les deux extrémités du gel. Migrant dans le gel en réponse au champ électrique, les protéines sont soumises à un PH qui change continuellement et provoque une modification continue de leur charge ionique. A un certain endroit le long du gel, chaque protéine rencontre un PH qui équivaut à son point isoélectrique ; elle devient une molécule neutre et sa migration s'arrète.chaque type de protéine se retrouve donc dans une bande très nette à un endroit spécifique le long du gel. GERALD, 1998).

2-7 Électrophorèse en gel à deux dimensions

En 1975,on mis au point une nouvelle  technique pour séparer les protéines suivant deux dimensions, technique basée sur des propriétés différentes des molécules.les protéines sont d'abord séparées en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans un gel en tube.après cette séparation, le gel est prélevé et placé dans une tablette de polyacrilamide saturé de SDS et soumis à la SDS-PAGE .les protéines se déplacent dans le gel de la tablette et se séparent en fonction de leur poids moléculaire.la résolution de la technique est telle que l'on peut pratiquement distinguer toutes les protéines présentes dans une cellule en quantité décelable. On peut, par cette méthode séparer plus de 1.000 protéines différentes. (GERALD, 1998).

 

- Détection de la protéine :

Après séparation par électrophorèse en gel, les bandes obtenues peuvent être localisées par différentes techniques. Les protéines sont sauvent révélées par :

- Coloration

a) Bleu de commassie

Les colorants de Coomassie ( R-250 et G-250 ) se lient à des protéines par des interactions ioniques entre les groupes de colorants d'acide sulfonique et positifs des groupes amine des protéines .Les deux Coomassie colorants bleus, R-250 et G-250 , diffèrent que par deux groupes méthyle. En fonction, le plus populaire de Coomassie R-250 est plus sensible alors que G-250 est plus commode.[ 15]

 

La plupart des méthodes de coloration impliquent une certaine version des étapes d'incubation mêmes:

•Un lavage à l'eau pour enlever tampons d'électrophorèse de gel de la matrice

•Un acide ou d'alcool à l'état laver ou fixer le gel à limiter la diffusion de bandes de protéines de la matrice

•Traitement avec le réactif colorant pour permettre au colorant ou chimique de se diffuser dans le gel et se lient (ou réagir avec) les protéines

•Décoloration d'enlever l'excédent de teinture à partir de la matrice de gel de fond [17]

b) Coloration de l’argent :

 Lorsque la quantité de protéines y est plus faible encore, on peut les révéler  par coloration à l’agent, Environ 50 fois plus sensible mais plus difficile à utiliser.Les groupe sulfhydrile et carboxylique des chaines latérales des protéines peuvent réduire l'ion argent.

L'ion argent réduit est sensible à la lumière (principe du film photographique).La réaction est stoppée en milieu acide(22)

Au nitrate d'argent permet de détecter des spots contenant 0,1 ng de protéines. Elle présente néanmoins certains inconvénients : la stœchiométrie de la coloration n'est pas totalement linéaire, la reproductibilité est difficile à obtenir et certaines protéines sont peu ou pas colorées par cette méthode. (18)

c) coloration de La fluoresacamine

Autre colorant des protéines, La fluoresacamine  est une molécule non fluorescente  qui, après réaction avec des amines primaires comme la lysine, forme un produit très fluorescent après irradiation par UV.(4) Fluorescamine réagit avec les groupes amino primaires présents dans les acides aminés terminaux et la e-amine de la lysine pour former des fragments fluorescente pyrrolinone il ne réagit pas avec des amines secondaires et des formes non-fluorescentes produit d'addition lors de la liaison à libres NH 3. (19)

2-8 Comptage radioactif :

Comme d’autres substances, les protéines peuvent être détectées par absorption en UV sur toute la longueur du gel. Si l’échantillon est radioactif, on peut soit sécher le gel sous vide , ce qui donnera au gel l’aspect de la cellophanes, soit l’envelopper de plastique puis le mettre au contact d’un film sensible aux rayons X. après un certains temps ( de quelques minutes à plusieurs semaines selon l’intensité des radiations).le film est développé et l’autoradiographie obtenue donne la postions des composés radioactifs, les quels noircissent le film ( on peut aussi utiliser un détecteur sensible aux radiations-un film électrotronique-qui révélera la position des composés radioactifs en quelques secondes).on peut également découper le gel dans le sens de la largeur  et mesure dans un compteur  à scintillation l’intensité de radioactivité de chacune de tranches obtenues. Cette dernière méthode est quantitative et donne des résultats plus précis que l’autoradiographie. On peut encore éluer les produits contenus dans les tranches de gel pour les identifier et/ou les soumettre à tout autre traitement. (VOET.D ET VOET.J.G, 2005)

2-9 Immunotransfert « western blot » :

Une technique efficace pour détecter une protéine donnée dans un mélange complexe combine le pouvoir élevé de résolution de l’électrophorèse sur gel, la spécificité des anticorps et la sensibilité du test enzymatique. Appelés transfert de type western ou immunotransfert, cette procédure à multiple étape est couramment utilisé pour séparer des protéines pis pour identifier une protéine particulière :

1-après l’électrophorèse d’un mélange de protéines dans un gel, les bandes séparées sont transférées du gel verts une membrane poreuse. (7) nitrocellulose ou de PVDF .celle-ci lie fortement les protéines de façon non spécifique (des membranes de nylon ou de difluorure de polyvinylidine (PVDF°peuvent également être  utilisées).

La membrane est placée face-à-face avec le gel, et un courant électrique est appliqué aux grandes plaques sur l'un des deux côtés. Les protéines chargées migrent depuis le gel vers la membrane en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans le gel. Il résulte de ce transfert que les protéines sont exposées sur une surface mince, ce qui facilite les étapes de détection ultérieures. Bien que les membranes de nitrocellulose soient moins chères que celles en PVD F, elles sont moins solides et ne peuvent être employées plusieurs fois. (8)

 

2-la membrane est saturée à l’aide d’une solution d’anticorps (AC) spécifiques de la protéine recherchée à température ambiante pendant 2 heures. Seule le bande contenant cette protéine fixe l’anticorps, conduisant à la formation d’une couche de molécules d’anticorps (bien que leur position ne soit pas visible à ce stade).après un  temps suffisant pour permettre la fixation, la membrane est lavée pour enlever les AC 1 non lié.

3- la membrane est incubée en présence d’un second anticorps (Ac2) qui se fixe à l’AC 1 lié pendant 1 heure à température ambiante. (LODISH.H et all, 2005).

L’anticorps 2 généralement lié liés  avec enzyme à la biotine ou à une enzyme qui permet l'identification visuelle de la protéine étudiée sur la membrane, comme une phosphatase alcaline (enfin le substrat est ajouté et un précipité violet foncé se forme identifiant la bande contenant la protéine recherchée) ou la peroxydase de raifort.

-Détection colorimétrique :

Cette méthode est tributaire, lors de l'incubation du transfert de western, de la présence d'un substrat qui réagit au déclencheur [enzyme], Cela convertit un colorant soluble en une forme insoluble, de couleur différente, qui précipite à côté de l'enzyme, teintant donc la membrane de nitrocellulose Les teneurs en protéines sont évaluées par densitomètre (l'intensité de la tache est) ou spectrophotométrie.

-Détection par chimioluminescence :

Cette méthode nécessite, lors de l'incubation du transfert de western, la présence d'un substrat qui émet de la lumière après exposition au déclencheur présent sur l'anticorps secondaire. La lumière émise sert à impressionner un film photographique, ou plus récemment, par des caméras CCD qui restituent une image numérique du transfert de western. L'image est analysée par densitomètre, qui évalue le taux relatif de marquage de la protéine, et quantifie les résultats en termes de densité optique. Des logiciels permettent une analyse plus poussée des données, comme l'analyse du poids moléculaire si les standards appropriés sont utilisés. Cette méthode appelée détection améliorée de la chimiluminescence (enhanced chemiluminescent, ECL) est considérée comme l'une des méthodes de détection les plus sensibles pour l'analyse des westerns blots.

-Détection par autoradiographie :

Marqueurs radioactifs ne nécessite pas substrats enzymatiques, mais permettre le placement de radiographie médicale film directement contre le western blot qui se développe comme il est exposé à l'étiquette et crée des régions sombres qui correspondent aux bandes de protéines d'intérêt. L'importance des méthodes de détections radioactives est en déclin en raison de son rayonnement dangereux car il est très cher, risques pour la santé et la sécurité sont élevés.

-Détection par fluorescence

La sonde couplée à l'anticorps est excitée par un rayon monochromatique et l'émission qui en résulte est alors détectée par une photo senseur, par exemple une caméra CCD équipée des filtres en transmission appropriés, qui restitue une image numérique du transfert de western et permet une analyse plus fine telle que l'analyse du poids moléculaire ou quantitative du transfert de western. La fluorescence est considérée comme d'un niveau à peu près équivalent à la chimiluminescence pour l'analyse des transferts de western. Elle nécessite un outillage plus coûteux toutefois. (20)

 

 Dans chaque procédé de détection par transfert de Western, un signal détectable est généré à la suite de liaison d'un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt. La détection colorimétrique (A), le signal est un précipité coloré. Dans chimioluminescence (B), la réaction s’émet de la lumière. La détection de fluorescence (C), l'anticorps est marqué avec un fluorophore. (21)

 

1-Applications :

En médecine : le Tests électrophorèse des protéines est utilisés pour évaluer, et contrôler une grande variété de maladies et de conditions grâce à l'examen des quantités et des types de protéines dans un sang, d'urine, Identification des phénotypes moléculaires et des génotypes par électrophorèse de l'hémoglobine. (25)

En génétique : La variation génétique peut aussi être identifiée en examinant la variation au niveau des enzymes et  la vérification des études d'expression des protéines in vivo et in vitro. (26)

En pharmacie : Permettant la découverte de nouveaux médicaments et la validation des cibles pour la conception de médicaments. (27)

En biochimie : pour Fournit des informations sur la structure la taille moléculaire, le paramètre physico-chimique,  la quantité et la pureté d'un échantillon de protéine. (28)

En  biotechnologie : L'industrie des biotechnologies a connu une croissance rapide ces dernières années en grande partie attribuable au développement et au succès de base de protéines thérapeutiques pour un large éventail de troubles. Similaires aux produits pharmaceutiques traditionnels, la caractérisation d'une protéine thérapeutique pour ses propriétés physico-chimiques, la surveillance du processus et l'émission de lots est essentielle. (29)

Médicaments biotechnologiques sont des médicaments qui sont des protéines thérapeutiques telles que les anticorps monoclonaux, des protéines sanguines et des enzymes qui sont produites par une forme vivante spécifiquement pour aider à combattre la maladie. (30)

En immunologie, notamment pour confirmer le diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire.

2- Exemple d’utilisation d’électrophorèse :

La séparation et l'identification de protéines par électrophorèse de liquides biologiques Des pathologies rares affectant la production des anticorps comme l'agammaglobulinémie,absence de sécrétion des gammaglobulines et l'hypogamma globulinémie, sécrétion insuffisante des gammaglobulines, peuvent être détectées par électrophorèse des protéines sériques.

Dans le but d'identifier la nature de leur pathologie, on a soumis à l'électrophorèse le sérum de deux patients atteints de dysfonctionnements du système immunitaire. 

Outre le sérum des deux patients (pistes 2 et 3), on a également soumis à l'électrophorèse deux échantillons de sérum normal (pistes 1 et 5) ainsi qu'un échantillon d'immunoglobulines pour servir de référence (piste 4).

Les résultats obtenus et le profil densitométrique des pistes sont présentés ci-dessous à droite.(23)

 

3-Avantage :

- la quantité de produit nécessaire est très petite

- des protéines ne différant que par un seul acide aminé peuvent être séparées

- des méthodes enzymatiques et immunologiques permettent la révélation des substances

- il est possible de quantifier les différentes fractions séparées

- cette méthode est extrêmement simple, La simplicité et les performances de cette méthode lui valent d'être utilisée quotidiennement.

4-Inconvénient :

-Les bandes de protéines sont larges (à cause du dépôt).

-On ne peut pas déterminer la masse moléculaire des protéines.

-Réfléchir sur la polarité de l'électrophorèse (en fonction du pH). (24)

Conclusion : 

La masse moléculaire et la composition des  sous-unités  d’une protéine, même présent en petites quantités, peuvent être déterminées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide  SDS. Lors d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel, les protéines sont séparées sous forme de taches par la focalisation isoélectrique dans une dimension suivie de l’électrophorèse sur gel  de polyacrylamide SDS dans la deuxième dimension. Cette séparation électro phorétique peut aussi être appliquée à des protéines  normalement insolubles dans l’eau.