les vecteurs de clonage

1. Généralités

Les vecteurs sont des petits ADN dans lesquels on insère un fragment d’ADN que l’on veut étudier. Le vecteur est un ADN capable de s’auto répliquer et qui est utilisé pour porter un ADN étranger. Les vecteurs les plus utilisés sont généralement les plasmides les bactériophages et leurs dérivés. Il est nécessaire d’introduire ces bactériophages ou plasmides dans les bactéries pour réaliser une multiplication de ceux-ci (ces vecteurs assurent la propagation et la réplication d l’ADN insert dans la cellule hôte)

Le vecteur, généralement un ADN (procaryotique) circulaire, doit être coupé à l’endroit où la séquence à amplifier va être insérer. Pour éviter que le vecteur ne se referme sur lui-même et revenir à son état initial, il faut traiter ses extrémités par une phosphatase alcaline.

L’ADN à insérer est préparé de façon à ce que ses extrémités soient compatibles (complémentaires) avec celles du vecteur. Le mélange ADN à insérer et vecteur sont préparés à des proportions déterminées et en présence d’une ligase qui assurera la ligation des extrémités de l’ADN à insérer et celles du vecteur. Dans le cas où la liaison entre les extrémités du vecteur et de l’ADN à insérer ne se fait pas, il faut envisager de modifier ces extrémités en ajoutant une queue oligo G sur le vecteur et une autre oligo C sur l’ADN à insérer. Une fois les recombinants purifiés par extraction et précipitation, le vecteur est prêt

pour son incorporation à l’intérieur de la cellule hôte.

La cellule hôte est choisie de sorte qu’elle ne détruise pas l’ADN recombiné qui vient d’y être introduit. Il est alors préférable d’utiliser alors des souches mutantes dépourvues d’enzymes de restriction. La transformation est réalisée dans une suspension bactérienne en présence du vecteur recombinant lequel va traverser la membrane rendue perméable suite à des traitements chimiques à base de sel de calcium (CaCl₂).

Selon la taille, la nature des fragments et les objectifs visés, divers vecteurs d’origine naturelle ou artificielle peuvent être utilisés :

Tableau 1. Différents vecteurs et taille de l'insert accepté.

2. Critères de choix des vecteurs

Le vecteur doit posséder les caractéristiques suivantes pour pouvoir être utilisé.

a)- il doit être capable de s’auto répliquer (il doit posséder une origine de réplication)

b)- il doit porter une caractéristique permettant de sélectionner les cellules transformées (les cellules transformées sont celle qui ont reçu le vecteur).

c)- le vecteur doit contenir au moins un site de restriction pour rendre l’insertion d’un fragment d’ADN possible (plusieurs sites de restrictions uniques)

Les vecteurs utilisés pour reproduire un fragment d’ADN sont dits « vecteurs de clonage »

Les vecteurs utilisés pour exprimer un gène sont dits « vecteurs d’expression »

3. Les plasmides

Les plasmides sont des petits fragments d’ADN circulaire présents dans la cellule bactérienne et indépendants du génome bactérien.

3.1 Les propriétés des plasmides

Les plasmides présentent les caractéristiques suivantes

·         Leur ADN est bicaténaire, circulaire avec un nombre de nucléotides inférieur à 10 kb (1 kilobase = kb = 1000 nucléotides).

·         Le nombre de plasmides dans une cellule bactérienne peut être considérable (plusieurs centaines).

·         Les plasmides portent normalement des gènes qui leur confèrent un avantage sélectif, par exemple une résistance à un antibiotique.

·         Leur réplication est indépendante de celle du génome bactérien.

3.2 Préparation des plasmides recombinants

L’insertion d’une séquence d’ADN bicaténaire dans un plasmide nécessite un traitement préalable par une enzyme de restriction. On choisit une enzyme qui a un site unique dans la séquence plasmidique. Après action de l’enzyme de restriction, le plasmide circulaire est linéarisé. Pour maintenir la linéarisation, il est indispensable de traiter le plasmide linéaire par une phosphatase alcaline qui enlève les groupements phosphates en 5’. Le plasmide linéarisé et traité par une phosphatase alcaline est ajouté au fragment d’ADN à insérer en présence d’une ligase. L’ensemble de ces étapes produit un plasmide recombinant (Figure 1).

Les bactéries peuvent être placées dans certaines conditions physico-chimiques pour permettre aux plasmides d’être incorporés à l’intérieur de celles-ci. Les bactéries traitées et prêtes à recevoir l’ADN étranger sont appelées bactéries compétentes. L’incorporation des plasmides dans les bactéries est appelée transformation bactérienne.

                                 

Figure 1 : Insertion d’un fragment d’ADN dans un plasmide

3.3 Sélection des bactéries transformées par des plasmides

Le taux de transformation des bactéries est généralement très faible. Il est fondamental de disposer de méthodes permettant d’obtenir des bactéries transformées par les plasmides et seulement celles-ci. Pour cela, l’artifice consiste à utiliser une résistance à un antibiotique (par exemple: l’ampicilline). La transformation d’une bactérie sensible à un antibiotique par des plasmides portant un gène de résistance au même antibiotique aboutit à l’apparition d’une résistance uniquement pour les bactéries ayant incorporé les plasmides (Fig. 2).

Cette technique permet de séparer les bactéries comportant des plasmides et les bactéries sans plasmides car ces dernières sont tuées  (Fig. 2). Cependant, elle ne permet pas de distinguer les bactéries avec plasmides intacts des bactéries avec plasmides recombinants. On utilise pour cela une résistance à un second antibiotique, par exemple: une tétracycline. L’insertion du fragment d’ADN dans le plasmide doit inactiver le gène de résistance au deuxième antibiotique. Les bactéries transformées par les plasmides recombinants sont donc résistantes au premier antibiotique (ampicilline) et sensibles au deuxième antibiotique (tétracycline). Les bactéries non transformées sont sensibles aux deux antibiotiques (Fig. 3)