Les enzymes de restriction

 

a. Généralités

Les enzymes de restriction sont de véritable « outils » utilisés au laboratoire pour couper le DNA. La coupure se fait en un site particulier, reconnu par l’enzyme. Il existe une centaine d’enzymes de restriction. Chacun reconnait une séquence de nucléotides différente, qui lui est spécifique.

b. Séquences d’ADN reconnues par les enzymes de restriction (Sites de restriction)

Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement des séquences nommées «palindromes ». Un « palindromes », en littérature, est un mot, une phrase, que l’on peut lira aussi bien de gauche à droite, que de droite à gauche (par Exp. : « radar »). Par analogie, on appelle palindrome, en biochimie, des séquences de DNA à symétrie inversée, comme la séquence encadrée ci-dessous, ou la succession des nucléotides est la même pour le brin I lu de gauche à droite (de 5’ vers 3’) que pour le brin II lu de droite à gauche (également de 5’ vers 3’).

Il existe des palindromes de toutes longueurs (plus court, ou beaucoup plus longs), mais les palindromes reconnus par les enzymes de restrictions sont généralement  constitués de séquences contenant  4 ou 6 pdb (paires de bases).

 c. Origine des enzymes de restriction

Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactéries. En effet, Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à ADN. Pour se défendre, les bactéries synthétisent des enzymes de restriction qui couperont le DNA de ce virus (ils sont capables de cliver les ADN étrangers). Pour éviter une auto-destruction de leur propre ADN, elles se protègent contre leurs propres enzymes de restriction par une modification des sites de restriction correspondants (voir paragraphe g).

d. Nomenclature des enzymes de restriction

Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. On donne aux enzymes de restriction des noms à 3 (ou 4) lettres qui rappellent l’origine de micro-organisme d’où ils sont été isolés. La première lettre (en majuscule) est la 1^er lettre du nom du genre ; la 2^ème et la 3^ème (en minuscules) sont les deux premières du nom d’espèce ; parfois il existe une 4^ème lettre (Exp. : Hind) elle indique alors la souche bactérienne d’où extrait l’enzyme. Le chiffre romain concerne l’ordre de caractérisation des enzymes, lorsque plusieurs enzymes ont été isolés à partir d’une même souche bactérienne. La lettre R, lorsqu’elle est mentionnée, indique qu’il s’agit d’une endonucléase (par opposition à M qui désigne une méthylase). Par exemple à titre indicatif :   

Eco RI : extraite d’Escherichia coli souche R, 1^ère enzyme isolée de cette souche.

 site reconnu: G / AATTC

Sma I extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG

Pst I extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G

e. Types de coupures réalisées par les enzymes de restriction

Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures: la coupure à bouts francs et la coupure à bouts collants (Fig. 1)

La coupure à bouts francs aboutit (ou à extrémités franches)  à une coupure au milieu de la séquence palindromique. La coupure à bouts collants (ou à extrémités adhésives) correspond à une coupure qui se fait de part et d’autre du centre de symétrie.

                              bouts collants                                                                 bout franc

                      EcoRI                                                PstI                                                            SmaI

Figure 1 : coupure des séquences de DNA par des enzymes de restriction avec formation de bouts collants ou de bouts francs

            Une enzyme de restriction est donc capable de repérer sur toute la longueur d’un DNA certaines séquences caractéristiques. Reprenons l’exemple de l’enzyme (EcoRI) qui reconnait la séquence :

Si cette séquence se trouve 5 fois dans une molécule de DNA, l’enzyme coupera ce DNA en ces 5 endroits. Le DNA donnera donc 5 fragment s’il s’agit d’un DNA circulaire (ou 6 dans le cas d’un DNA linéaire). Bien évidement, un autre enzyme de restriction reconnaîtra une autre séquence différente de celle reconnue par EcoRI. Selon l’enzyme utilisé, un même DNA sera coupé différemment.

f. Remarque sur les enzymes de restriction de type I et III

Au laboratoire, on utilise des enzymes de restriction qui reconnaissent spécifiquement un palindrome, ce sont les enzymes dites de type II. Toutefois, il ne faut pas en déduire que tous les enzymes de restriction connus agissent systématiquement au niveau d’un palindrome. Certain souche de bactéries possèdent d’autres types d’enzymes de restriction.

Les enzymes de type I reconnaissent des séquences particulières mais qui ne possèdent cependant aucune symétrie, par exemple la séquence :

T G A . . . . . . . . T G C T

(Où chacun des 8 points représentent n’importe laquelle des 4 bases).

Ces enzymes coupent le DNA non pas au niveau de la séquence qu’ils ont reconnue, mais en un endroit qui peut être situé à environ 1000 pdb de ce site et qui sera variable d’une molécule à l’autre.

Les enzymes de type III reconnaissent une séquence et coupent une vingtaine de nucléotides plus loin.

D’autre part, alors que les systèmes de type II comprennent 2 enzymes (restriction, modification), ceux de type I et III ne comprennent qu’un même enzyme qui possèdent les 2 activités (ces enzymes ont plusieurs sous-unités).

N.B : Seules les enzymes de type II qui coupent au niveau du site de reconnaissance sont utilisés en génie génétique parce qu’on peut contrôler parfaitement le site de coupure et donc les extrémités engendrées

g.  Les enzymes de modification

Les enzymes de modification sont des enzymes que possèdent les bactéries pour se protéger contre une autodestruction. En effet les bactéries utilisent leurs enzymes de restriction pour couper le DNA d’un virus voulant les parasiter. Etant donné que les bactéries contiennent également du DNA, il ne faut pas que l’enzyme de restriction qu’elles s synthétisent pour lutter contre un virus coupe également leur propre DNA. Toute bactérie non (suicidaire !) doit donc « modifier » ses palindromes afin qu’ils ne soient pas reconnus par ses propres enzymes de restriction. La modification effectuer est un simple méthylation, grâce à des enzymes dits « méthylase de modification » ou encore « enzyme de méthylation ». Ces méthylase méthylent la cytosine (sur le carbone en 5), ou l’adénine (sur l’azote en 6). Elles sont très spécifiques puisque la méthylation porte uniquement sur les cytosines et adénines appartenant à des sites de restriction. Elle différent en cela d’autres méthylases bactériennes susceptible de méthyler indifféremment cytosine et adénine en dehors des sites de restriction.

Du fait que le site de restriction est palindromique, la base à méthyler se retrouve sur les 2 brins. Que le site soit pleinement  méthylé (c’est-à-dire sur les 2 brins) ou hémi-méthylé (c’est-à-dire sur un seul brin), il ne sera pas couper par l’enzyme de restriction. Ainsi, pendant la courte période qui suit la synthèse d’une chaine de DNA, le DNA double brin, constitué du DNA nouvellement synthétisé (qui n’a pas encore été méthylé), et du brin parental (méthylé), sera protégé de la coupure par un enzyme de restriction.

En résumé, un site hémi-méthylé, une méthylase peut agir (pour méthyler le 2^ème brin), mais non une enzyme de restriction (pour couper la molécule de DNA).

    

Figure 2 : la méthylation inactive l’enzyme de restriction

h. Notion d’isoschizomères

Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des mêmes sites spécifiques, on les appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent souvent après clivage enzymatique des fragments dont les extrémités sont différentes.

Exemple : soit la séquence suivante: G-G-T-A-C-C, cette séquence est coupée par l’enzyme Kpn I et l’enzyme Acc65 I:

i. Notion d’enzymes compatibles

Deux enzymes de restriction sont dites compatibles quand elles génèrent après digestion des fractions aux extrémités cohésives complémentaires. Ces fragments peuvent être facilement ligaturés.

Exemple: Les enzymes Bam HI (G/G-A-T-C-C) et Mbo I (A/G-A-T-C-A):