conservation des souches microbiennes

Sommaire

Introduction

1-Définition de la conservation des souches microbiennes………………………...

2-L’objectif de conservation d’une souche …………………………………………

3-Méthode de conservation des souches…………………………………………….

3.1-Repiquage successifs……………………………………………………………...

3.2-Congélation ………………………………………………………………………

3.3-Dessiccation ……………………………………………………………………...

3.4-Lyophilisation …………………………………………………………………....

4-Explication théorique des altérations dues au froid……………………………

5-Principes de la cryoprotection…………………………………………………...

6-Les applications …………………………………………………………………..

Conclusion

Références bibliographique

..................................."Introduction".............................................      

Une fois qu’un milieu de culture a été préparé et stérilisé afin d’éliminer tous les micro-organismes, il peut être inoculé (c’est-à-dire que des organismes y sont ajoutés) et être incubé dans des conditions qui favoriseront la croissance microbienne. Au laboratoire, l’inoculation sera généralement réalisée à partir d’une culture pure, culture contenant seulement une seule espèce de micro-organisme. Pour le but de maintien en culture pure ces micro-organismes tels que les levures, les  champignons inférieurs, les bactéries et les virus, et pour usage ultérieur et étude, il doit être conservée dans son état original.(MADIGAN et MARTINKO,2007).

1-Définition de la conservation des souches microbiennes 

C’est une  méthode utilisée dans les laboratoires pour conserver les cultures des différentes espèces microbiennes isolées. Ces cultures servent des souches de référence c’est-à-dire gardé constant l’ensemble de ces propriétés morphologique, métabolique, génétique et physiologique. Elles sont fréquemment utilisées soit pour l’enseignement, soit pour le contrôle, soit pour la recherche, soit pour la production industrielle. (A.Meyer et al, 2004).

2-L’objectif de conservation d’une souche 

• En attente d’examens complémentaires.

• En cours d’analyse, il peut parfois être utile de comparer la souche d’une infection en cours avec les souches d’infections précédentes.

• Pour éviter les mutations et les changements phénotypiques et garder les caractéristiques intéressantes d’une culture

• La conservation doit évidemment exclure les contaminations.( www.perrin33.com /génie... /conservation_souches_generalites.php).

3-Méthode de conservation des souches 

3.1-Repiquages successifs 

C’est une méthode courant utilise des tubes de milieu solide inclinés ou en culot.une fois ensemencés, les tubes sont placés à l'étuve pour que la croissance débute puis, avant qu'elle ne soit trop abondante, les tubes sont placés dans une armoire réfrigérée à 4°c ou parfois laissés à température ambiante. La vitalité de la souche se maintient pendant des durées variables, selon la température et l'éspèce microbienne. Au bout de ce délai, un nouveau repiquage est réalisé. Les levures et champignons se conservent très bien au réfrigérateur pendant 3 à 6 mois; les bactéries se conservent assez facilement à température ambiante mais demandent des repiquages plus fréquents. La réplication fréquente des repiquages peut entrainer des variations de souches en particulier lorsqu'il s'agit des souches sélectionnées ou marquées génétiquement. Il est conseillé de conserver dans ce cas les repiquages antérieurs et d'effectuer  le nouvel ensemencement à partir du tube le plus ancien. En cas d'échec on renouvelle l'opération avec des tubes plus récents. La fréquence des repiquages peut être ralentie et la conservation accrue en recouvrant le tube de milieu ensemencé d'une couche de paraffine stérile qui limite les échanges gazeux. D’autre part, les éspèces bactériennes anaérobies ou aéro-anaérobies peuvent être conservées en gélose en culot, dans des tubes scellés. Une technique particulière s'applique aux bactéries acidophiles comme par exemple

les bactéries lactiques: une culture est réalisée sur milieu favorable puis elle est immédiatement repiquée sur milieu ne permettant pas une abondante : ce dernier est seul conservé, ce qui évite l’auto-destruction de la culture par une acidification trop importante du culture.  

On a pu ainsi conserver de cette manière divers champignons filamenteux durant plus de 25 ans.

Pourtant, par ce procédé, on peut perdre certaines des caractéristiques de la souche. Par exemple, stm. Griseus perdra 50% de sa capacité à produire de la streptomycine au bout de 4 repiquages et pour ainsi dire  la totalité de cette propriété au bout de 10.(GUIRAUD,1998).

3.2-Congélation 

Bien que notre propos soit la destruction des micro-organismes, il faut dire que, souvent, la technique de contrôle la plus pratique est d’inhiber leur développement par la congélation ou la réfrigération. Cette méthode est particulièrement importante en microbiologie alimentaire. (CLAIRE et al, 2003)  .

Deux paramètres importants parmi d’autres conditionnent la mise en œuvre de ce procédé : le choix de la température et surtout la vitesse d’abaissement à la température choisie.

Pour conserver dans des meilleures conditions les structures cellulaires. Il convient de congeler à la température la plus basse (souvent de -25°c à -80°c) qui arrête la croissance des micro-organismes à cause de la température basse et l’absence d’eau liquide et d’y parvenir dans les délais les plus brefs.

De plus, l’addition d’agents dits cryoprotecteurs permettra d’éviter au maximum les altérations cellulaires dues au refroidissement. Mais ces agents seront d’autant plus efficaces que la vitesse de congélation sera faible.

En général, on travaille avec une vitesse de 1°C. min^-1 jusqu’à - 30 ou - 40°C, avec comme agent protecteur du glycérol à 10% ou du DMSO (diméthylsulfoxyde). Ensuite, les souches congelées seront conservées sous azote liquide à – 196°C ou sous vapeur d’azote à – 120°C parce que l’azote liquide empêche les réactions enzymatique comme les ribonucléases (RNAses) qui sont actives aux températures supérieures à – 70 °C et dégradent les prélèvements à long terme.

Pour leur remise en culture, il sera préférable d’assurer une décongélation la plus rapide possible. (A.Meyer et al ,2004).

-Certain  micro-organismes seront tués par la rupture des membranes due à la formation des cristaux de glace mais la congélation ne détruit pas les germes contaminants.

-  La conservation au froid est couteuse en énergie et en surveillance. (http://www.perrin33.com/genie_ferment  /conservation_souches_generalites.php)

3.3-Dessiccation 

L'eau est le solvant des réactions chimiques du vivant. Après dessiccation, les réactions chimiques seront arrêtées (au moins ralenties) et la conservation effective. (www.perrin33.com/génie.../conservation_souches_dessiccations.php).

C’est un procédé simple à mettre en œuvre, consiste à déshydrater en utilisant la chaleur sèche ou des produits chimiques comme l’anhydride phosphorique. Pour cette opération, les microorganismes sont disposés sur des supports inertes (Kieselguhr, bandes de papier, cylindres préséchés d’amidon, de dextrane, disques de gélatine, billes de verre, etc.….).(A.Meyer et al,2004).

Après la dessiccation, il faut assurer un stockage parfaitement sec, en général vers 0-4°C (conteneur étanche avec dessiccateur dans une ambiance réfrigérée).

 La revivification s'effectue par immersion dans du milieu de culture. (www.perrin33.com/génie.../conservation_souches_dessiccations.php).

3.4-Lyophilisation 

C’est un procédé de conservation des produits biologiques par dessiccation sous vide à basse température. Ici, les suspensions de microorganismes sont tout d’abord congelées à basse température puis mises sous vide. Ici les suspensions de micro-organismes sont tout d’abord congelées à basse température puis mise sous vide.

L’abaissement de la pression en dessous du point d’équilibre, dit point triple ( P= 610 Pa, T°= 0,01°C ), entraine une sublimation de la glace, c’est-à-dire son passage de l’état solide à l’état gazeux sans passer par la phase liquide. La phase de désorption permet d’éliminer l’eau restante. Protégées de l’oxygène, de l’humidité et de la lumière, les suspensions peuvent ainsi être conservées pendant très longtemps. (A.Meyer et al, 2004).

La formation d’une poudre qu’il est facile de conserver  en ampoules scellées  pour une durée très longue et ordinaire. (GUIRAUD,1998).

En utilise d’agent cryoprotecteurs comme  le lait écrémé pour éviter l’altération des micro-organismes.

·         La revivification (réhydratation) est réalisée par ajout de milieu de culture dans l'ampoule de lyophilisat. Ce fait par les étapes suivantes :

        

Ensuite, incuber dans les conditions spécifiées de température et d'atmosphère.

Puis, placer dans le flacon :

Aussi, incuber dans les conditions spécifiées de température et d'atmosphère.( http://cip. pasteur.fr /presentation.html)

  La lyophilisation n'est pas compatible avec tous les microorganismes. Dans certains cas elle occasionne des altérations cellulaires et génétiques.

Tableau : Comparaison entre les méthodes de conservation.

La méthode	Température de conservation	Elément de conservation	Durée de conservation	Exemples
Repiquages successifs	4°C	Gélose incliné ou en culot	3 à 6 mois	Streptomyces
Congélation	-25°C à -80°C	Bouillon nutritifs	4 à 10 ans ou 20 ans selon G+ ou G-	Pneumocoque neisseria
Ultracongélation	-196°C	Azote liquide ou vapeur d’azote	20 ans	Haemophilus
Lyophilisation	0 à 4°C	Gélose	Plusieurs années	Halobactérium
Dessiccation	4°C	Anhydride phosphorique	Plusieurs années	Entériobactéries

4-Explication théorique des altérations dues au froid :

• 1963 Mazur, Oak Ridge, Tennessee (Etats-Unis) explique pourquoi certains organismes unicellulaires, par exemple des levures, peuvent survivre suite au refroidissement lent   (1/min).

• L’eau congelable se cristallise a l’extérieur des cellules , les cellules se déshydratent, se rétrécissent et l’eau sort de la cellule: c’est la formation de glace intracellulaire qui serait létal.

•Il est indispensable d’utiliser des cryoprotecteurs( PAVEL et al,2008) .

5-Principes de la cryoprotection :

• L’utilisation des cryoprotecteurs intracellulaires augmente la fraction non congelée, diminue la concentration osmotique en électrolyte et prévient la déshydratation excessive des cellules.

• Voici d’éventuels mécanismes d’action des cryoprotecteurs non pénétrants : inhibition de la nucléation, inhibition de la croissance des cristaux, fixation d’eau et donc prévention d’une déshydratation excessive des cellules.( PAVEL et al, 2008).

6-Les applications

• La conservation est une technique plus utilisable dans la microbiologie industrielle et la biotechnologie.

• Importance médicale :

La conservation d'une souche isolée sur un patient et transmise pour études complémentaires (typages moléculaire précis, études de réactions particulières vis à vis d'antibiotiques ...) et à conserver dans le cadre d'une enquête épidémiologique. Une conservation de courte durée sur quelques semaines ou quelques mois peut suffire.

• En génie biologique :

La conservation d'une souche sélectionnée et/ou obtenue par génie génétique pour une production en génie fermentaire (par exemple une souche destinée à la production industrielle d'un antibiotique ou d'une molécule à très haute valeur ajoutée). Il s'agit au minimum de conserver absolument les caractéristiques d'intérêt biotechnologique pour tout l’inoculum qui devront être gérés pendant la période d'exploitation de la souche. Et c'est assez délicat pour de telles souches qui ont tendance à dériver vers la sous-production. En effet, les cellules qui produisent le composé d'intérêt biotechnologique – composé qui n'a pour elles aucun intérêt si ce n'est de baisser leur rendement physiologique - sont en général moins prolifiques que les cellules qui ont perdu cette activité : la pression de sélection naturelle est favorable à la disparition des caractéristiques d'hyperproduction mises au point. D'où l'intérêt d'une conservation très au point  et pour plusieurs années.

• En taxonomie :

La conservation des souches types dans un souchier de niveau international pour taxonomistes : dans l'idéal il faut assurer une conservation à l'infini et parfaite des souches types.

• Pour l’industrie alimentaire.

(www.perrin33.com/génie.../conservation_souches_generalites.php).

Conclusion

La conservation est varie selon la souche sélectionné et selon l’objectif de recherche et la durée de conservation varie aussi selon l’objectif de la recherche : courte et longue durée.

Pour courte durée en travaille avec les repiquages successifs, pour longue durée en travaille aves les autres méthodes : congélation, dessiccation et lyophilisation.